制備型液相色譜（LC）簡(jiǎn)介
色譜是根據(jù)混合物中各組分的化學(xué)特性對(duì)其進(jìn)行分離的一種分離方法。制備型(Prep)色譜或純化色譜則是指利用色譜方法分離出一定量達(dá)到足夠純度的化合物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或處理的色譜方法?？茖W(xué)家首先要確定目標(biāo)化合物，然后開發(fā)色譜方法，將目標(biāo)化合物從原料、副反應(yīng)或其它雜質(zhì)中成功分離出來。其總體目標(biāo)是滿足日益增長(zhǎng)的高通量和高效率需求，同時(shí)運(yùn)用各種純化技術(shù)達(dá)到相應(yīng)的規(guī)模、純度和重現(xiàn)性要求。
從大型制藥企業(yè)到小規(guī)模天然產(chǎn)物研究團(tuán)隊(duì)，純化色譜在眾多科研機(jī)構(gòu)中應(yīng)用非常廣泛。盡管應(yīng)用領(lǐng)域各不相同，用戶的一般要求卻非常相似，他們都希望分離出的終產(chǎn)物純度能達(dá)到95％或更高。
本初學(xué)者指南旨在為液相色譜工作者介紹快速發(fā)展的LC純化領(lǐng)域，內(nèi)容包括色譜分離方法開發(fā)、方法放大所需的數(shù)學(xué)公式以及常用的餾分收集模式等基本原理。鑒于大多數(shù)制備型LC應(yīng)用都使用反相分離模式，本指南將主要介紹該分離模式。
采用液相色譜進(jìn)行純化
LC純化系統(tǒng)的配置與一般液相色譜系統(tǒng)相同，但增加了餾分收集器。樣品混合物被進(jìn)樣至色譜柱，色譜柱根據(jù)組分特有的化學(xué)或物理性質(zhì)對(duì)其進(jìn)行分離。檢出組分時(shí)，系統(tǒng)會(huì)將其輸送至廢液，或者進(jìn)行收集用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。洗脫液收集操作既可由分析人員在組分洗脫時(shí)通過簡(jiǎn)單的手動(dòng)方式完成，也可以全自動(dòng)進(jìn)行，在自動(dòng)收集操作中，檢測(cè)器信號(hào)會(huì)觸發(fā)餾分收集器將液流輸送至收集容器中。輸送至收集容器的餾分純度取決于分離過程中化合物與其它鄰近洗脫雜質(zhì)的分離度。
圖1：制備型LC系統(tǒng)
判斷純化分離成功與否的標(biāo)準(zhǔn)包括通量、回收率和所得分離物的純度。純化分離由色譜峰的分離或“分離度”驅(qū)動(dòng)。以下是對(duì)分離度影響最為顯著的色譜參數(shù)：
- 色譜柱填料（固定相）
- 溶劑強(qiáng)度
- 溶劑類型
- 緩沖液添加劑
- 柱溫
通過執(zhí)行方法開發(fā)工作流程，可確定實(shí)現(xiàn)理想分離度的條件。該工作流程非常簡(jiǎn)單，但包含多個(gè)步驟，各步驟的復(fù)雜性和必要性根據(jù)樣品的獨(dú)特性質(zhì)而異。無論樣品分離用于何種應(yīng)用、采用哪種模式（例如反相色譜、離子交換色譜等），方法開發(fā)工作流程通常都是相同的。
圖2：通用制備型工作流程
在設(shè)計(jì)工作流程之前，十分重要的考慮因素是目標(biāo)化合物的性質(zhì)。如果從熟知的來源或新來源中分離已知化合物，很容易通過檢索相關(guān)文獻(xiàn)獲取有關(guān)目標(biāo)化合物色譜行為的信息，并從已發(fā)表的方法中選擇適用的分離方法。而對(duì)于含有未知類型化合物的粗提取物，設(shè)計(jì)分離方案的難度較大。在這種情況下，可在初始分離之后進(jìn)行一系列探索性實(shí)驗(yàn)，獲取更多有關(guān)目標(biāo)化合物的信息，例如pKa、分子量、溶解性、穩(wěn)定性、UV光譜和生物活性等。然后根據(jù)這些信息修改初始分離方法，使其符合化合物的化學(xué)和物理性質(zhì)要求。這些信息不僅有助于方法開發(fā)，還可以在收集到餾分之后，為掌握目標(biāo)產(chǎn)物的穩(wěn)定性提供非常大的幫助。
第一步要制備樣品并使用快速探索梯度執(zhí)行常規(guī)分離。這一步通常為小規(guī)模分離，目的是節(jié)省寶貴的樣品。根據(jù)該分離的結(jié)果，可以計(jì)算洗脫目標(biāo)化合物的溶劑條件并進(jìn)一步優(yōu)化分離條件，盡可能提高分離度。此外，可能還需要對(duì)上樣量進(jìn)行研究，確定可維持適當(dāng)分離度以實(shí)現(xiàn)高純度分離的理想上樣量。
確定分離方法和理想上樣量后，通常要針對(duì)具有應(yīng)用前景或潛在價(jià)值的分離物進(jìn)行方法放大（但并不是必須執(zhí)行）。在本初學(xué)者指南中，術(shù)語“規(guī)模”(scale)旨在描述滿足產(chǎn)物純度、通量和收率等應(yīng)用目標(biāo)所需的儀器和方法。若要“放大”(scaled-up)方法，則需要將方法轉(zhuǎn)換至硬件配置可處理更高上樣量的系統(tǒng)。從本質(zhì)上來講，方法放大就是借助一系列方法放大計(jì)算和硬件更改，在分離度保持不變的前提下，將方法從分析級(jí)內(nèi)徑色譜柱轉(zhuǎn)換到制備級(jí)內(nèi)徑色譜柱的過程。
圖3：用于分析級(jí)和制備級(jí)純化的色譜柱內(nèi)徑對(duì)比
樣品
可用于分離特定化合物的樣品來源十分廣泛，包括藥物中間體、天然產(chǎn)物、保健食品、飲料和工業(yè)產(chǎn)品等。只要原料可以進(jìn)行提取并溶解于液體基質(zhì)中，就可以使用色譜純化其中的各組分。
樣品提取技術(shù)的選擇取決于待提取原料的復(fù)雜性。對(duì)于天然產(chǎn)物，通常將樣品干燥并研磨成細(xì)顆粒用以提高提取效率。接下來采用滲濾（用于大體積樣品）或浸提（用于小體積樣品）等技術(shù)提取目標(biāo)化合物。這兩種技術(shù)都需要向樣品原料中加入溶劑，然后在超聲、渦旋或浸泡后收集溶質(zhì)。收集提取物之后，和所有HPLC樣品一樣，樣品在進(jìn)樣前必須過濾，以除去顆粒并排除氣泡。
分離模式
制備型色譜主要有四種分離模式：反相、正相、凝膠滲透和離子交換。合適的分離模式取決于待分析樣品、提取物或混合物與固定相和溶劑之間的相容性。
反相色譜是開發(fā)純化方法時(shí)最常用的技術(shù)，其使用極性弱于洗脫溶劑極性的固定相。反相色譜使用水與乙腈或甲醇的混合物作為洗脫液，其中還會(huì)添加緩沖液（酸或堿）用于控制樣品的離子化程度以及結(jié)合固定相中未反應(yīng)的游離硅醇基團(tuán)。硅膠型固定相中的鍵合相材料或吸附劑采用甲硅烷基化試劑進(jìn)行了衍生化處理，可減少峰拖尾并提高色譜重現(xiàn)性。上述衍生化試劑處理（硅烷化）以及不同的碳載量將賦予不同制造商的色譜柱獨(dú)特的分離特征1。
快速啟動(dòng)方法開發(fā)
建立反相分離方法時(shí)，通常選擇小規(guī)格的分析型色譜柱（內(nèi)徑≤ 4.6 mm），并且其柱長(zhǎng)和填料應(yīng)可擴(kuò)展至較大規(guī)格（內(nèi)徑≥ 10 mm）內(nèi)徑的色譜柱，以便將來放大方法。方法開發(fā)的關(guān)鍵是找到可實(shí)現(xiàn)出色分離的適用溶劑體系。對(duì)于酸性化合物，通常采用pH為酸性的水性流動(dòng)相，并以甲醇或乙腈作為強(qiáng)溶劑。濃度為0.1%的甲酸是常用的緩沖液添加劑，因?yàn)槠浼嫒軺V和質(zhì)譜檢測(cè)。如需鑒定未知化合物或獲取純分離物用于進(jìn)一步研究，MS兼容性將非常有用。如需讓堿性分子保持未電離狀態(tài)，可使用pH為堿性而非酸性的流動(dòng)相。使用任何pH的緩沖液之前，都應(yīng)參閱色譜柱固定相說明書了解其兼容性。水性流動(dòng)相通常由位置A處的泵泵送，強(qiáng)溶劑由位置B處的泵泵送。本初學(xué)者指南將分別使用“A”和“B”指代泵表中的水性溶劑和強(qiáng)溶劑。
探索
盡管復(fù)雜的分離受色譜柱填料選擇性的影響最大，但在開發(fā)純化分離方法時(shí)，通過快速探索梯度得到初始樣品分離方法并優(yōu)化是十分有效的方法開發(fā)途徑。探索梯度的作用是大致確定從色譜柱上洗脫目標(biāo)化合物所需的溶劑濃度。探索梯度一般從一致的強(qiáng)溶劑濃度(2%-10%)開始，線性增加至25%、50%、75%和90%-95%。
表1：快速線性梯度探索研究示例
圖4：快速探索梯度。隨著梯度斜率減小，分離度增大2
運(yùn)行探索梯度之后，在進(jìn)行下一步之前應(yīng)審查并評(píng)估所得結(jié)果，弄清以下問題：
- 快速探索梯度的分離度是否足以分離目標(biāo)化合物？
- 快速探索梯度的速度或效率是否滿足要求？
- 采用所需上樣量時(shí)，目標(biāo)化合物與其它峰能否保持分離？
如果探索梯度結(jié)果未達(dá)到要求，可通過方法聚焦進(jìn)行優(yōu)化，也可通過更改pH值、溶劑或其它色譜變量對(duì)分離方法進(jìn)行整體調(diào)整。
優(yōu)化方法
通過改變強(qiáng)溶劑和弱溶劑組成可優(yōu)化目標(biāo)化合物分離度理想的探索梯度。溶劑組成可以保持恒定（等度），也可以根據(jù)給定的單位時(shí)間或色譜柱體積進(jìn)行變化（梯度）。
等度洗脫
在等度分離中，弱溶劑和強(qiáng)溶劑比率在單位時(shí)間內(nèi)保持不變。等度溶劑可由分析人員離線制備，或使用能以恒定的預(yù)定流速配比不同溶劑的HPLC泵通過在線混合制得。這種洗脫模式便捷、一致且穩(wěn)定，因?yàn)樵谙到y(tǒng)間轉(zhuǎn)移方法時(shí)，延遲體積對(duì)保留時(shí)間的影響可以忽略不計(jì)。
等度洗脫有一定缺陷，并不是所有分離都適用。它的一些固有問題包括：早期洗脫峰分離度低、因峰拖尾導(dǎo)致峰對(duì)稱性不佳、由于譜帶增寬導(dǎo)致靈敏度降低，以及由于強(qiáng)保留化合物積累導(dǎo)致色譜柱污染問題等。
梯度洗脫
反相色譜或離子交換色譜中的梯度分離通常在線混合流動(dòng)相，以便在整個(gè)分析過程中使有機(jī)溶劑比例穩(wěn)定升高。梯度開始時(shí)，溶劑強(qiáng)度較低，分析物會(huì)被分配到固定相中或保留在色譜柱柱頭。隨著溶劑強(qiáng)度增加，分析物被轉(zhuǎn)移到流動(dòng)相，沿色譜柱移動(dòng)，最終被
洗脫。
梯度洗脫可在合理的時(shí)間范圍內(nèi)分離疏水性不同的多種分析物。另外，梯度洗脫還可提高峰分離度，由于峰高增加，靈敏度也有所提升。強(qiáng)保留組分會(huì)在運(yùn)行結(jié)束時(shí)從色譜柱中洗脫出來，因此還可盡可能減少色譜柱污染。
當(dāng)然，梯度洗脫也存在一些弊端。該方法要求實(shí)現(xiàn)一致、無脈沖的在線梯度混合，因此通常需要昂貴的泵設(shè)備。此外，采用某些溶劑的組合混合流動(dòng)相時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生沉淀。由于梯度結(jié)束后需要重新平衡，運(yùn)行時(shí)間會(huì)很長(zhǎng)，而且因?yàn)閮x器駐留時(shí)間(Vd)不同，若
不適當(dāng)使用補(bǔ)償溶劑，會(huì)帶來方法轉(zhuǎn)換問題。
線性梯度
在整個(gè)運(yùn)行過程中，線性梯度的強(qiáng)溶劑比例以恒定速率增加。該方法常在快速篩選實(shí)驗(yàn)中被用于快速確定洗脫目標(biāo)峰的溶劑比例，同時(shí)保持較短的運(yùn)行時(shí)間，從而縮短洗脫時(shí)間并降低溶劑成本。
圖5：線性梯度的溶劑曲線
分段梯度
分段梯度是多個(gè)線性梯度的組合，每個(gè)區(qū)段具有不同的斜率或陡度。平緩的區(qū)段用于分離目標(biāo)化合物，而陡峭的區(qū)段是對(duì)色譜圖分離度要求不高的區(qū)域（例如分離后的清洗過程）。
圖6：分段梯度的溶劑曲線
梯度聚焦
梯度聚焦通常比分段梯度的運(yùn)行時(shí)間更短且變化更大。一般情況下，剛進(jìn)樣時(shí)流動(dòng)相的溶劑強(qiáng)度非常低，接下來溶劑強(qiáng)度會(huì)迅速升至洗脫目標(biāo)化合物所需的溶劑比例以下2%-5％（例如，洗脫濃度22% - 2％ = 20％開始平緩梯度）。然后運(yùn)行平緩梯度，梯度斜率約為快速探索分離所確定的斜率的1/5，最后終止于目標(biāo)化合物的洗脫濃度以上2%-5％（例如，22% + 2% = 24%終止平緩梯度）。最后，溶劑百分比快速增加，用以清洗殘留在色譜柱中的所有樣品組分。
圖7：梯度聚焦的溶劑曲線
開發(fā)梯度聚焦
采用快速探索梯度分析樣品之后，可利用以下公式為目標(biāo)化合物開發(fā)梯度聚焦。每個(gè)公式之后都附有理論示例。
首先必須確定探索梯度運(yùn)行所用儀器的系統(tǒng)延遲體積。關(guān)于延遲體積測(cè)定的說明可參閱本初學(xué)者指南的“延遲體積測(cè)定”部分，或訪問www.waters.com/prepcalculator ，使用“分析級(jí)至制備級(jí)梯度轉(zhuǎn)換器”應(yīng)用工具獲取。
此外，還需確定探索梯度運(yùn)行所用色譜柱的柱體積。使用圓柱體體積V = πr2h和除去填料所占體積之后的可用柱體積比例可計(jì)算出該值，例如V = πr2h (66%)?！胺治黾?jí)至制備級(jí)梯度轉(zhuǎn)換器”應(yīng)用程序工具也可用于執(zhí)行此計(jì)算。
公式1：色譜柱體積
公式2：梯度形成和檢測(cè)器之間的補(bǔ)償體積
公式3：到達(dá)檢測(cè)器所需的時(shí)間到達(dá)檢測(cè)器所
公式4：達(dá)到洗脫濃度的時(shí)間
公式5：洗脫濃度(%)
公式6：色譜柱體積(CV)數(shù)
公式7：探索梯度斜率
公式8：梯度聚焦斜率
梯度聚焦區(qū)段為：估算洗脫比例以下5%至該比例以上3%~5%。例如，洗脫比例為79％。
公式9：梯度聚焦區(qū)段的時(shí)長(zhǎng)
最后一步是使用上述公式計(jì)算出的值創(chuàng)建梯度聚焦。
探索梯度:
|
時(shí)間 (mins) |
流速 (mL/min) |
溶劑 |
|
|
%A |
%B |
||
|
0.00 |
1.5 |
95 |
5 |
|
7.00 |
1.5 |
5 |
95 |
|
8.00 |
1.5 |
5 |
95 |
|
9.00 |
1.5 |
95 |
5 |
梯度聚焦:
|
時(shí)間 (mins) |
流速 (mL/min) |
溶劑 |
|
|
%A |
%B |
||
|
0.00 |
1.5 |
95 |
5 |
|
1.00 |
1.5 |
26 |
74 |
|
4.32 |
1.5 |
16 |
84 |
|
6.00 |
1.5 |
5 |
95 |
|
7.00 |
1.5 |
95 |
5 |
圖8：采用快速梯度和梯度聚焦分離萘普生、苯氧苯丙酸、雙氯芬酸和異丁苯丙酸所得的結(jié)果對(duì)比。可以看到用星號(hào)標(biāo)記的目標(biāo)峰在梯度聚焦分離中分離度更高且保留時(shí)間更短
替代方法開發(fā)
如果等度分離或梯度聚焦都不能完全分離目標(biāo)化合物，可以通過更改溶劑、pH值、固定相和/或溫度重新開發(fā)分離方法。這類修改會(huì)對(duì)分離產(chǎn)生顯著影響，因此進(jìn)行以上任何更改之后都必須運(yùn)行探索梯度并進(jìn)行方法優(yōu)化。
溶劑
HPLC流動(dòng)相由三種組分組成：弱溶劑、強(qiáng)溶劑和改性劑。溶劑必須具有高純度、可與檢測(cè)器兼容、不與樣品反應(yīng)，并且粘度應(yīng)較低，以保持低系統(tǒng)背壓。
反相色譜通常以水作為弱溶劑，常用的強(qiáng)溶劑是乙腈和/或甲醇，因?yàn)樗鼈冋扯鹊?、溶劑?qiáng)度高，并且在短波長(zhǎng)范圍內(nèi)兼容UV檢測(cè)。此外，乙腈和甲醇還能提供理想峰形，分離之后易于通過蒸發(fā)去除，而且不與大多數(shù)樣品反應(yīng)。
和所有用于色譜分離的溶劑一樣，分析樣品時(shí)必須保持檢測(cè)波長(zhǎng)高于已知的溶劑UV截止波長(zhǎng)值。若波長(zhǎng)低于該值，檢測(cè)器會(huì)將溶劑組分變化記錄為基線漂移或其它色譜干擾。
表2：常用色譜溶劑及其UV截止波長(zhǎng)
峰分離和出峰順序會(huì)根據(jù)分離所用的強(qiáng)溶劑不同而改變。預(yù)測(cè)可使目標(biāo)化合物達(dá)到最高分離度的溶液非常困難，因此，通常需要通過試錯(cuò)法來確定強(qiáng)溶劑?；蛘?，也可以使用混合強(qiáng)溶劑（例如，50:50乙腈/甲醇）達(dá)到理想的洗脫順序或分離度。
圖9：乙腈和甲醇的洗脫順序?qū)Ρ?
pH值
流動(dòng)相pH值是控制反相分離保留性的一個(gè)非常重要的變量。化合物通常都含有一個(gè)或多個(gè)酸性或堿性官能團(tuán)，因此大多數(shù)反相流動(dòng)相的pH值都有必要加以控制。
當(dāng)酸的pH高于或低于其pKa 2個(gè)以上pH單位時(shí)，99％以上的酸將分別處于電離或未電離狀態(tài)。相反，堿在pH值低于其pKa時(shí)電離，在pH值高于pKa時(shí)為未電離狀態(tài)。未電離物質(zhì)的極性較?。ǜ杷?，因而在反相體系中保留性更強(qiáng)。因此，酸在低pH值條件下保留性更好，而堿在高pH值條件下保留性更好?。
圖10：流動(dòng)相pH值對(duì)分析物保留性的影響。選擇對(duì)應(yīng)于保留圖穩(wěn)定區(qū)域的流動(dòng)相pH值可實(shí)現(xiàn)十分穩(wěn)定的分離。非電離形式的酸和堿保留性非常理想，而中性分析物的保留性不受pH值影響
如果流動(dòng)相pH值接近目標(biāo)化合物的pKa，則很小的pH值變化也會(huì)顯著影響其保留性，從而直接影響分離穩(wěn)定性。我們通過添加緩沖液來控制流動(dòng)相pH值。加入少量酸或堿時(shí)，緩沖液可保持pH值不變。緩沖液在其pKa ±1個(gè)pH值單位范圍內(nèi)使用十分有效，不過有的緩沖液在其pKa ±2個(gè)pH值單位范圍內(nèi)也具有足夠的緩沖能力。
圖11：化合物選擇性與pH值。酸性和堿性化合物的洗脫順序因其電離情況不同而發(fā)生了顯著變化，而中性化合物未受影響
在選擇運(yùn)行pH值時(shí)，還應(yīng)考慮色譜柱穩(wěn)定性。硅膠基色譜柱在pH 2至pH 8之間性能非常理想。鍵合相在低pH值下易水解，而在高pH值下，硅膠主鏈會(huì)變得易溶解。當(dāng)pH值高于8時(shí)，需要使用非硅膠基質(zhì)顆粒或具有專用鍵合相（在高pH值條件下穩(wěn)定）的顆粒。pH值限值和通用處理建議可參閱色譜柱說明書或訪問色譜柱制造商網(wǎng)站。
圖12：基于沃特世表面帶電雜化(CSH)硅膠基質(zhì)的專用鍵合相示例及其建議pH值范圍
當(dāng)色譜方法用于純化目的時(shí)，用于調(diào)節(jié)pH的緩沖液添加劑必須具有足夠的揮發(fā)性，以便從純化后的分離物中去除。此外，使用揮發(fā)性添加劑時(shí)，必須注意避免MS源被污染或產(chǎn)生沉淀。甲酸、乙酸和醋酸銨等常用添加劑以0.05%~0.1％的濃度溶解于流動(dòng)相時(shí)性能非常理想。不建議在純化或MS應(yīng)用中使用液相色譜分離最常用的緩沖液添加劑 - 磷酸鹽。
建議的緩沖液濃度為5~10 mM。如需使用緩沖液，應(yīng)在制備完成后進(jìn)行過濾，不使用時(shí)應(yīng)沖洗泵管路，以避免在線沉淀，還需定期更換溶液以防止微生物生長(zhǎng)積聚。
圖13：流動(dòng)相緩沖液選擇指南，附MS兼容性
固定相
色譜柱固定相會(huì)顯著影響分離。反相色譜使用C18到C8的固定相，某些固定相還含有專為提高選擇性和分離能力而設(shè)計(jì)的鍵合相。許多實(shí)驗(yàn)室的色譜柱庫存有限，因此更換固定相通常是調(diào)整溶劑和pH值均無法達(dá)到足夠分離度時(shí)的最后選擇。沃特世常見色譜柱選擇卡(www.waters.com)可對(duì)比不同制造商色譜柱固定相的選擇性。在方法開發(fā)的早期階段，該工具非常適合用于比較色譜柱選擇性。
圖14：沃特世常見色譜柱選擇卡，可通過www.waters.com/selectivitychart 上的Web Toolbox（網(wǎng)絡(luò)工具箱）訪問
柱長(zhǎng)
色譜柱柱長(zhǎng)也是影響分離性能的因素之一。市面上有多種色譜柱柱長(zhǎng)可供選擇，包括25 mm、50 mm、100 mm、150 mm和250 mm。較短的色譜柱塔板數(shù)較少，適用于快速分離，而較長(zhǎng)的色譜柱塔板數(shù)較多，因此保留時(shí)間較長(zhǎng)。隨著柱長(zhǎng)增加，柱壓、運(yùn)行時(shí)間、溶劑消耗量和成本也會(huì)相應(yīng)地增加，因此能夠達(dá)到足夠分離度的盡可能短的色譜柱是十分理想的選擇。
圖15：不同柱長(zhǎng)色譜柱的分離度對(duì)比。100 mm色譜柱改善了主峰與鄰近雜質(zhì)之間的分離度，總運(yùn)行時(shí)間隨柱長(zhǎng)增加而延長(zhǎng)3
粒徑
樣品流經(jīng)填料時(shí)，色譜柱阻止樣品譜帶擴(kuò)散或展寬的能力稱為“柱效”。由于小顆粒內(nèi)的峰擴(kuò)散較低，小粒徑色譜柱的柱效更高。高柱效可使峰寬更窄，賦予色譜柱更強(qiáng)的分離能力。
制備型色譜柱的粒徑通常為5~10 μm，超高壓分析型分離則使用粒徑為1.7~3.5 μm的色譜柱。雖然極小的粒徑可帶來更高的柱效，但代價(jià)是色譜柱成本和系統(tǒng)背壓增加。出于以上原因，以較高流速分離粗制樣品混合物的大規(guī)模制備型色譜柱一般不會(huì)采用粒徑非常小的顆粒。
圖16：采用不同粒徑色譜柱分離相同物質(zhì)的色譜結(jié)果對(duì)比3
溫度
由于不同的溫度會(huì)影響色譜選擇性，因此加熱色譜柱是優(yōu)化具體樣品分離結(jié)果的一種非常方便的手段。流動(dòng)相粘度和系統(tǒng)整體壓力隨溫度升高而降低，進(jìn)而降低系統(tǒng)、接頭和色譜柱壓力，最終有利于提高運(yùn)行的穩(wěn)定性。調(diào)節(jié)溫度還可縮短保留時(shí)間并改變分離的選擇性。峰分離度會(huì)隨溫度變化增大還是減小很難預(yù)測(cè)，因而溫度對(duì)于每次具體分離有特定的影響。
盡管溫度控制是小規(guī)模色譜的常規(guī)控制手段，但制備級(jí)純化很少將溫度作為操控色譜分離的參數(shù)。首先，大內(nèi)徑色譜柱難以從外部均勻加熱。其次，大規(guī)模的高流速分離中通常會(huì)保持流入溶劑的溫度。雖然電熱毯和柱溫箱可滿足小規(guī)模分離的加熱需求，卻無法在直徑方向上均勻加熱大型色譜柱。因此，色譜柱直徑方向上會(huì)形成溫度梯度，對(duì)色譜分離產(chǎn)生不利影響。
若必須借助溫度控制來保持樣品溶解性，可在制備型色譜柱柱頭處連接一段管路，并將其放置在加熱的水浴中，以消除溫度梯度。這一段管路被用作預(yù)加熱器，將流入溶劑平衡至所需溫度?。將來需要放大的色譜方法最好在室溫條件下開發(fā)，盡量不使用溫度控制手段。
圖17：制備級(jí)色譜柱加熱。制備型色譜柱柱頭連接的5 mL定量環(huán)浸沒在水浴中，用作溶劑預(yù)加熱器?
方法放大
若初步證明某分離物具有潛在價(jià)值，可“放大”分離方法，分離出更大量的該分離物以供進(jìn)一步評(píng)估。要在大規(guī)模分離中維持小規(guī)模分離的各項(xiàng)屬性（如分離度等）很容易。必須借助已定義的數(shù)學(xué)公式修改流速、上樣量和系統(tǒng)硬件參數(shù)，從而有效地將分離方法
轉(zhuǎn)移至更高容量的色譜柱。
方法放大的第一階段通常是獲取mg級(jí)到g級(jí)的分離物用于從早期生物學(xué)評(píng)價(jià)到建立具有改進(jìn)治療特性的產(chǎn)品類似物的結(jié)構(gòu) - 活性關(guān)系等多種用途。方法放大的下一階段需要獲取100 g到數(shù)千克（或更多）的目標(biāo)物質(zhì)用于臨床前和臨床開發(fā)，如果開發(fā)成功，將最終決定全面投產(chǎn)。這種規(guī)模的分離要用到良好生產(chǎn)規(guī)范(cGMP)等指導(dǎo)文件和質(zhì)量控制手段1。
表3：色譜規(guī)模、目標(biāo)物質(zhì)量和相關(guān)應(yīng)用。
方法放大工作流程分為幾個(gè)步驟。必須保證放大計(jì)算的準(zhǔn)確性，否則最終可能無法達(dá)到小規(guī)模分離的分離度。為了提高方法放大的成功率，同時(shí)維持保留時(shí)間和選擇性不變，需要仔細(xì)考慮以下要求：
- 小規(guī)模和大規(guī)模分離必須使用相同的流動(dòng)相。
- 使用填料、柱長(zhǎng)和粒徑相同的色譜柱非常容易進(jìn)行方法放大（或者在保持初始方法的柱長(zhǎng)-粒徑比率(L/dp)不變的前提下改變粒徑）。
- 應(yīng)使用相同的稀釋溶劑制備濃度相同的樣品。
圖18：方法放大工作流程。
確定延遲體積
在放大方法或更改系統(tǒng)時(shí)，延遲體積（即系統(tǒng)體積或死體積）對(duì)于維持早洗脫峰的峰分離度很重要。延遲體積是指梯度形成處到色譜柱柱頭之間的體積。在高壓混合LC系統(tǒng)中，該體積主要包括混合器、連接管路和自動(dòng)進(jìn)樣器定量環(huán)的體積。低壓混合系統(tǒng)包括來自泵的上游溶劑，因此這些額外的管路體積加上泵頭（一個(gè)或多個(gè)）體積，再加上混合器、連接管路和自動(dòng)進(jìn)樣器定量環(huán)的體積共同組成了總延遲體積。
圖19：導(dǎo)致延遲體積的純化流路組件（用虛線圈出）。
等度分離的流動(dòng)相組分通過在線方式混合，這種情況下仍然存在延遲體積，但由于流動(dòng)相濃度恒定，色譜分離結(jié)果中觀察不到差異。另一方面，梯度方法則依賴流動(dòng)相濃度隨時(shí)間的變化實(shí)現(xiàn)峰分離。在梯度方法中補(bǔ)償延遲體積可確保峰保留時(shí)間得以維持，需要收集純餾分時(shí)，這一點(diǎn)尤為重要。
如需測(cè)定延遲體積，可根據(jù)www.waters.com/prepcalculator 上的“分析級(jí)至制備級(jí)梯度轉(zhuǎn)換器”所用的方法，采用流動(dòng)相A和含有UV吸收能力不同的添加劑（例如0.05 mg/mL尿嘧啶或0.2％丙酮的乙腈溶液）的流動(dòng)相B溶劑組成分級(jí)梯度進(jìn)行測(cè)定。
表4：確定延遲體積的步驟。
圖20：用于測(cè)定分析型系統(tǒng)和制備型系統(tǒng)的系統(tǒng)體積的分級(jí)梯度。
色譜柱容量
在純化色譜分離中，保持目標(biāo)化合物具有足夠的分離度是一個(gè)關(guān)注重點(diǎn)。色譜柱容量（或稱上樣量）以化合物與鄰近峰的分離度為衡量標(biāo)準(zhǔn)。雖然色譜柱容量主要受色譜柱柱長(zhǎng)和內(nèi)徑影響，樣品溶解性和樣品混合物的復(fù)雜性等其它因素對(duì)此也有一定影響。色譜柱容量的趨勢(shì)如下：
- 色譜柱容量主要取決于具體樣品的溶解性。
- 簡(jiǎn)單混合物的色譜柱容量更高。
- 如果需要較高的分離度，應(yīng)降低色譜柱容量。
- 色譜柱容量在很大程度上取決于上樣條件。
表5：常用制備型色譜柱規(guī)格的估計(jì)上樣量(mg)。
示例：以4.6 x 50 mm的色譜柱為例，其預(yù)計(jì)上樣量為每20 μL進(jìn)樣對(duì)應(yīng)3 mg。
在方法放大之前，應(yīng)通過上樣量研究來確定特定目標(biāo)化合物的理想上樣量。這些研究以小規(guī)模進(jìn)行，并采用以下其中一種方法：制備高濃度樣品，然后逐步增大進(jìn)樣體積；或者制備多個(gè)濃度的樣品，進(jìn)樣體積保持恒定。這兩種方法的目標(biāo)都是在保持目標(biāo)化合物與鄰近雜質(zhì)之間具有足夠分離度的前提下，確定可進(jìn)樣的最大樣品濃度或進(jìn)樣體積。確定色譜柱容量后，可利用公式將其放大，以便用于內(nèi)徑更大的色譜柱和大規(guī)模工作流程。
圖21：上樣量研究?？梢钥吹叫翘?hào)標(biāo)注的峰的分離度隨上樣量增大而降低。
公式10：上樣濃度放大
因此，要將4.6 mm x 50 mm分析型色譜上1800 μg (1.8 mg)的上樣量等效放大至19 mm x 50 mm制備型色譜柱：
公式11：進(jìn)樣體積放大
要放大20 μL的進(jìn)樣體積：
柱頭稀釋
DMSO等強(qiáng)溶劑可以改善樣品溶解性，進(jìn)而可能增大色譜柱容量。然而，進(jìn)樣大體積的強(qiáng)溶劑會(huì)導(dǎo)致色譜峰畸變，這反而會(huì)減少可成功分離的產(chǎn)物量。若強(qiáng)溶劑從進(jìn)樣器輸送到柱頭的過程中在水性溶劑流中間形成溶劑簇，就會(huì)導(dǎo)致峰畸變。溶劑簇邊緣的強(qiáng)樣品溶劑被水性溶劑稀釋，可能會(huì)引起樣品沉淀，這種沉淀可能會(huì)堵塞流路塞，進(jìn)而導(dǎo)致高壓系統(tǒng)關(guān)閉。
圖22：流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)稀釋樣品簇。如果使用強(qiáng)稀釋劑制備樣品，則樣品簇在流經(jīng)含有水性流動(dòng)相的色譜柱時(shí)，樣品簇邊緣可能會(huì)產(chǎn)生沉淀。
如果沉淀沒有導(dǎo)致系統(tǒng)關(guān)閉，樣品將進(jìn)入色譜柱，但色譜柱上不會(huì)有樣品被保留，直到樣品簇被流動(dòng)相稀釋。進(jìn)樣體積較大時(shí)，樣品簇必須沿著色譜柱移動(dòng)相當(dāng)長(zhǎng)的一段距離才能達(dá)到所需的稀釋度。在這種情況下，樣品沉積為寬譜帶，占據(jù)大部分色譜柱體積，這會(huì)導(dǎo)致需要大量洗脫液才能洗脫出很寬的峰，且峰分離度不足。通過嚴(yán)格限制進(jìn)樣體積和上樣量可以避免這種情況。替代方法是用水或弱溶劑對(duì)樣品進(jìn)行充分稀釋，以確保足夠的保留性能。
圖23：將樣品溶于強(qiáng)溶劑中進(jìn)樣的傳統(tǒng)進(jìn)樣方法。樣品簇在沿著色譜柱移動(dòng)的過程中被稀釋，會(huì)導(dǎo)致峰畸變。
由于通量和回收率受到影響，上述兩種方法都不理想。柱頭稀釋系統(tǒng)采用另一種配置，能夠在色譜柱入口處使用水性稀釋劑流對(duì)輸送至此的樣品簇進(jìn)行連續(xù)稀釋。輸送至色譜柱的流速非?？?，因此不會(huì)產(chǎn)生沉淀。接下來，樣品分子會(huì)被吸附到填料上，形成非常窄的譜帶，進(jìn)而被洗脫為分離良好的小體積峰。柱頭稀釋還使得樣品不容易在定量環(huán)或柱頭處發(fā)生沉淀，因此能改善系統(tǒng)穩(wěn)定性。由于樣品組分峰之間的分離度得以改善，我們可以增大進(jìn)樣量，從而減少分離所需的進(jìn)樣次數(shù)。在實(shí)際操作中，采用柱頭稀釋通?？蓪⑸V柱上樣量提升3~5倍。發(fā)生高壓關(guān)閉的頻率降低，色譜柱壽命也更長(zhǎng)。
圖24：柱頭稀釋系統(tǒng)。樣品簇被輸送到色譜柱入口，并在此經(jīng)水性稀釋劑流連續(xù)稀釋，因而不會(huì)產(chǎn)生沉淀。樣品譜帶可洗脫為具有理想分離度的小體積峰?。
圖25：采用傳統(tǒng)進(jìn)樣方法和柱頭稀釋法進(jìn)樣溶于強(qiáng)溶劑的樣品結(jié)果對(duì)比。柱上進(jìn)樣量為1000 μL（相當(dāng)于133 mg）3。
流速放大
為了在放大過程中保障分離質(zhì)量，小規(guī)模和大規(guī)模色譜柱的線性流速必須保持恒定，因此在柱長(zhǎng)、粒徑和填料相同的大規(guī)模和小規(guī)模色譜柱之間進(jìn)行流速放大效果十分理想。放大流速時(shí)必須考慮系統(tǒng)的硬件能力，例如最大泵流量和背壓限制。如果硬件無法滿足流速要求，應(yīng)考慮更換合適的儀器以滿足放大要求。
公式12：流速放大
例如，假設(shè)分析型色譜柱(5 μm, 4.6 mm x 50 mm)的流速為1.5 mL/min，則制備型色譜柱(5 μm, 19 mm x 50 mm)的流速通過以下公式計(jì)算：
梯度持續(xù)時(shí)間放大
一般來說，如果可通過調(diào)節(jié)流速保持流動(dòng)相線性速度不變，進(jìn)行方法放大時(shí)不需要更改梯度。如果柱長(zhǎng)不同，則必須計(jì)算梯度時(shí)間，以保持小規(guī)模分離時(shí)的分離度和保留時(shí)間。
公式13：梯度時(shí)間放大
例如，50 mm分析型色譜柱上持續(xù)5 min的線性梯度區(qū)段在100 mm制備型色譜柱上應(yīng)為10 min：
制備轉(zhuǎn)換器
上樣量、流速和梯度的放大計(jì)算也可以通過制備型OBD方法轉(zhuǎn)換器執(zhí)行。該轉(zhuǎn)換器是一款操作簡(jiǎn)單的應(yīng)用程序，可執(zhí)行所有分析級(jí)到制備級(jí)的放大計(jì)算，包括上樣量、系統(tǒng)體積、流速、溶劑體積消耗量、質(zhì)譜引導(dǎo)的色譜分離方法的分流比計(jì)算，以及梯度聚焦UPLC方法到制備級(jí)方法的轉(zhuǎn)換等。您可以通過www.waters.com/prepcalculator 或沃特世純化軟件（如ChromScope?）訪問該應(yīng)用程序。
圖26：沃特世制備型OBD方法轉(zhuǎn)換器，可通過www.waters.com/prepcalculator 上的Web Toolbox（網(wǎng)絡(luò)工具箱）訪問。
